三阴性乳腺癌放射治疗的临床和相关细胞水平放射敏感性的研究

【摘要】第一部分三阴性乳腺癌改良根治术后的复发模式及放疗疗效分析目的：三阴性乳腺癌具有侵袭性的生物学行为,其局部控制率、无远处转移率、总生存率等均较差,近年来关于其放疗疗效的报道不一。本研究回顾性分析三阴性乳腺癌改良根治术后的复发模式和生存情况,评价术后辅助放疗的作用,并探讨早期三阴性乳腺癌未放疗者局部区域复发危险因素,探讨这部分患者中局部复发高危者进行术后的获益及可能性。材料和方法：回顾性分析2000年1月1日至2007年7月31日在我院接受改良根治术的资料完整的553例女性三阴性乳腺癌患者。三阴性定义为免疫组化检测ER、PR与HER2均阴性。根据不同的局部区域复发风险将全组患者分成高危组(pT3～T4和/或pN2-N3)、中危组(pT1～T2N1)和低中危组(DT1～T2N0～N1,non-PMRT)三个亚组。生存率计算采用Kaplan-Meier去,组间差异性检验采用log-rank法,多因素分析采用Cox比例风险模型。结果：中位随访时间65个月(1～140个月)。共51例(9.2%)出现局部区域复发,135例(24.4%)疾病复发,5年无局部区域复发率(LRFS)90.6%,5年无病生存率(DFS)75.9%。全组和高危组(T3-T4和/或N2-N3)患者,PMRT显著提高了LRFS和DFS；中危组(T1～T2N1)患者中,PMRT显著改善了DFS,对LRFS无显著影响。对中低危未接受放疗(T1～T2NO～N1,non-PMRT)的患者,年龄<50岁、LVI+、组织学3级和淋巴结3枚阳性是影响局部区域复发的独立危险因素,具有两个及以上危险因素者的5年LRR率>25%。结论：本研究结果肯定了高危组、中危组三阴性乳腺癌患者中改良根治术后辅助放疗的疗效,但放疗的疗效尚需进一步的提高。另外建议选择中低危组中局部复发风险高的患者,如具有两个及以上危险因素者进行术后辅助放疗。第二部分：三阴性乳腺癌细胞放射敏感性的基础研究第一章三阴性乳腺癌细胞的体外放射敏感性研究及与ERa表达的相互关系目的：临床资料显示,三阴性乳腺癌的局部复发风险高于ER阳性的Iuminal乳腺癌,可能原因之一是三阴性乳腺癌比ER阳性的Iuminal乳腺癌放射抵抗。但目前尚无相关基础研究数据支持这一推论。本课题拟在体外实验水平验证三阴性乳腺癌细胞株和Iuminal型乳腺癌细胞株放射敏感性的差异,探讨改变三阴性乳腺癌ERa表达后其生物学行为和放射敏感性的变化及其中的机制。材料和方法：采用单次照射细胞克隆形成实验检测不同乳腺癌细胞放射敏感性的差异。由于ER的主要效应形式是ERa,我们采用基因转染技术在三阴性乳腺癌细胞株中导入ERa的表达,在此基础上进一步验证三阴性乳腺癌细胞和ERa阳性细胞之间放射敏感性的差异。CCK-8法观察转染ERa后三阴性细胞细胞增殖能力的变化,分次照射克隆形成实验检测细胞亚致死性损伤修复能力的差异,细胞免疫荧光检测细胞间细胞核γH2AX焦点数的差异,流式细胞仪检测细胞照射后周期分布和凋亡比例的改变,Westernblot检测自噬相关蛋白的变化。结果：单次照射细胞存活曲线初步显示三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞(231细胞)的放射敏感性低于ERa阳性的MCF-7细胞。Westernblot检测结果显示采用基因稳定转染技术成功获得了ERa阳性表达的MDA-MB-231细胞(ER231细胞)。CCK-8细胞增殖实验结果显示,转染ERa后231细胞的细胞增殖能力降低；单次照射细胞克隆形成实验结果显示转染ERa后231细胞的放射敏感性增加；分次照射克隆形成实验结果显示,转染ERa后231细胞对照射的亚致死性损伤修复能力下降；免疫荧光结果显示,转染ERa后231细胞的双链断裂增多、修复延迟；流式细胞术结果发现转染ERa后231细胞在照射后的G2/M期的阻滞明显增加,细胞凋亡增多；自噬相关蛋白的检测结果显示,转染ERa后231细胞的自噬减少。结论：本实验结果发现三阴性乳腺癌细胞株较Iuminal型乳腺癌细胞株放射抵抗,并通过在三阴性乳腺癌细胞株中导入ERa表达进一步验证了此现象,支持临床上关于三阴性乳腺癌较Iuminal乳腺癌具有相对放射抗性的观察。在进一步的机制探索中发现,ERa表达可能通过抑制乳腺癌细胞增殖、促进照射后G2/M期阻滞、增加照射后DNA双链断裂、降低细胞对亚致死性损伤的修复、减少细胞自噬、进一步增加细胞凋亡比例等机制增加三阴性乳腺癌细胞的放射敏感性。第二章PARP抑制剂PJ34对三阴性乳腺癌细胞的放射增敏作用及其机制研究目的：本课题第一部分的研究结果显示,三阴性乳腺癌患者中放疗有效,但效应尚需进一步的提高；本课题第二部分的前期基础研究验证了三阴性乳腺癌细胞比ERa型细胞的放射敏感性更低的临床观察,并且发现三阴性乳腺癌细胞更强的DNA损伤修复能力是导致其相对放射抗拒的重要因素,因而我们推测针对性使用靶向DNA损伤修复的药物可能达到放射增敏作用。因此本课题拟从体外研究水平研究第三代PARP抑制剂PJ34这一DNA损伤修复抑制剂对三阴性乳腺癌细胞放射敏感性的影响及其中的机制。材料和方法：实验分为空白组、单纯药物组、单纯照射组和药物联合照射组。采用CCK-8法检测不同浓度的PI34对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231(231细胞)的生长抑制作用,并计算IC50值。CCK-8法检测不同浓度的PI34对照射后细胞增殖能力的影响；单次照射细胞克隆形成实验检测不同PI34浓度对231细胞放射敏感性的影响；分次照射克隆形成实验检测PJ34对231细胞亚致死性损伤修复能力的影响；细胞免疫荧光检测不同处理组细胞核γH2AX焦点数的差异；流式细胞仪检测不同处理组细胞周期分布和细胞凋亡之间的差异。结果：PI34对231细胞产生了时间依赖性的细胞生长抑制,处理24h、48h和72h后231细胞的IC50分别为17.90±0.46、18.12±0.65和15.15±0.91μM。选择处理24h组中20%～50%IC50范围内的3μM和10μM两个药物浓度进行后续的放射增敏实验。单次照射细胞存活曲线结果显示,PI34对231细胞有放射增敏效应；分次照射细胞存活曲线结果显示,PI34抑制了231细胞的亚致死性损伤修复的能力；细胞免疫荧光检测γH2AX结果显示PI34增加了照射后231细胞的DNA损伤、并延迟了损伤的修复；细胞周期检测结果显示,药物对照射后的两株细胞均产生了浓度依赖性和时间依赖性的G2/M期阻滞的增多；细胞凋亡检测结果发现,PI34对照射后231细胞的凋亡无明显影响。结论：本研究发现PJ34对三阴性乳腺癌细胞231细胞有放射增敏效应。其中可能的机制是PI34增加细胞照射后的增殖抑制,促进细胞G2/M期阻滞,减少细胞对亚致死性损伤的修复,增加DNA双链断裂损伤,从而达到放射增敏作用。
【作者】陈星星；
【导师】章真；
【作者基本信息】复旦大学，肿瘤学，2013，博士
【关键词】乳腺癌细胞；放射敏感性；细胞调亡；放射增敏；致死性损伤；克隆形成实验；细胞增殖能力；双链断裂；细胞周期；PARP；

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